MSI结直肠癌与MSS结直肠癌相比，在预后、治疗等方面均存在差异，而且与lynch综合征密切相关。MSI结直肠癌检测临床意义包括以下三个方面。

（1）预后性：临床研究发现，在Ⅱ期结直肠癌，MSI状态可作为预后的独立预测因子，

如图2所示，MSI-H Ⅱ期结直肠癌5年无复发生存率高于MSS Ⅱ期结直肠癌。即在Ⅱ期结直肠癌患者中，MSI-H状态提示良好预后。

图2 MSI-H Ⅱ期结直肠癌5年无复发生存率高于MSS Ⅱ期结直肠癌

（2）预测性：指导治疗

5-氟尿嘧啶（5-FU）是结直肠癌术后辅助治疗的重要化疗药物。Piero Benatti等开展回顾性研究发现，MSI-H Ⅱ期结直肠癌患者对5-FU治疗不敏感。NCCN指南指出MSI-H Ⅱ期结直肠癌患者有良好预后但不能从5-FU治疗获益。

（3）Lynch综合征的辅助诊断及筛查

Lynch综合征家族不仅发生结直肠癌的风险增高，还可以发生子宫内膜癌、卵巢癌以及胆管细胞癌等肠外肿瘤。从MSI-H结直肠癌中筛选出可疑患者，就个人而言早期诊断和预防性息肉切除术可以降低CRC死亡率。此外，还可以为患者家族成员提供肿瘤预防和筛查。研究表明，阿司匹林能够预防Lynch综合征相关肿瘤的发生。

在MSI结直肠癌中，MSI是分子特征，DNA错配修复基因缺陷是分子特征。因此，目前可用免疫组化检测DNA错配修复（MMR）基因相关蛋白的表达，以及基于PCR检测多个微卫星位点。

（1）免疫组化检测DNA错配修复蛋白：常规开展4 种MMR蛋白检测（MLH1、PMS2、MSH2、MSH6。错修复蛋白在正常肠腺上皮细胞以及淋巴细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞均表达，可作为内对照。对单个错修复蛋白来说，当内对照细胞核阳性而癌细胞全阴性（即没胞核着色）时，表明该蛋白表达缺失。总体上说，当肿瘤细胞出现一个或多个错修复蛋白缺失时，可判读为错配修复基因缺失（ MMR deficient， dMMR），提示肿瘤为MSI-H；当肿瘤细胞无错修复蛋白缺失，判读为错配修复基因无缺失（MMR proficient， pMMR），提示肿瘤为 MSI-L 或 MSS。

图3 免疫组化检测结直肠癌DNA错修复基因（MLH1、PMS2、MSH2、MSH6）表达

（2）PCR检测多个微卫星位点：该方法通过PCR扩增特定的微卫星序列（Bethesda指南5个位点），然后通过基因分析仪测序，最终比较正常和肿瘤组织的微卫星长度差异。如前所述，然后根据微卫星位点不稳定的数量，判读为MSI–H（具有两个或两个以上位点改变）、MSI–L（仅有一个位点发生改变)、MSS（没有位点发生改变）。

总体来说，免疫组化和PCR两种检测方法的敏感度和特异性均在90 %以上，且文献报道二者一致率可以达到97.8 %以上。错修复蛋白免疫组化检测结果如表1所示，其中最常见的免疫组化表达模式为MLH1-/PMS2-和MSH2-/MSH6-。与PCR方法相比，IHC检测结果可以揭示缺失的基因种类，有利于下一步基因测序分析或进一步筛查Lynch综合征。免疫组化由于简单、经济且更易于在病理科开展推广。此外，免疫组化对组织样本量要求不高，穿刺活检也适用。所以，免疫组化检测结直肠癌组织MMR可以作为一种初筛的手段。需要注意的是，少数错义突变导致错修复蛋白功能异常，由于保留“抗原性”导致免疫组化检测出现假阳性。PCR方法则可互补，但由于技术相对复杂、费用较高使得在基层病理科较难推广。

在正常的组织炎症反应中，PD-1/PD-L1通路是T细胞免疫反应的负反馈调节机制。肿瘤细胞通过高表达PD-L1与活化的T细胞表面PD-1结合，就像给免疫系统“踩刹车”。如果特异性阻断PD-1和PD-L1的结合即给免疫系统“松刹车”。各大药厂基于这样的原理研发一系列药物，如以PD-1为药物靶点的Pembrolizumab(Keytruda)、 Nivolumab(Opdivo)，以PD-L1为靶点的Tecentriq、Durvalumab。且抗PD-1/PD-L1免疫治疗在黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、肾细胞癌等均有较好的治疗响应率。

关于抗PD-1/PD-L1免疫治疗在结直肠癌中的作用，最初尝试的临床实验结果显示33例结直肠癌患者仅有1例得到缓解。得到缓解的这位患者与其他有何不同？2015年， Le DT等发表在New England journal of medicine里程碑式的发现：抗PD-1药物Pembrolizumab在错配修复缺陷(dMMR)的结直肠癌患者中反应率显著提高。该临床试验患者分成3组：A:10位错修复缺陷(dMMR)结直肠癌患者、B：18位错修复无缺陷(pMMR)结直肠癌患者、C：7位错修复缺陷(dMMR)的其他肿瘤（除了结直肠癌）。如表2所示，免疫相关客观反应率分别为40%、0、70%，免疫相关20周无进展生存率(%)分别为 78%、11%、67%。数据显示不仅dMMR的结直肠癌患者获益，而且dMMR的非结直肠癌患者，如子宫内膜癌、胆管癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌等也可从抗PD-1治疗获益。提示dMMR肿瘤患者均可从抗PD-1治疗获益。6月8日，Dung T. Le等science发表了《Mismatch-repair deficiency predicts response of solid tumors to PD-1 blockade》，该研究评估了PD-1抗体对12种dMMR肿瘤的治疗效果（图4），进一步证实了抗PD-1免疫治疗针对dMMR肿瘤患者的“实力”。

表2 MMR与抗PD-1临床实验数据

图4 PD-1免疫治疗获益的12种肿瘤类型

至于dMMR患者为什么能从抗PD-1治疗获益的机制并不清楚。文献报道可能的机制：dMMR结直肠癌更容易被T细胞浸润。对肿瘤细胞分析发现dMMR结直肠癌在肿瘤浸润面、腺癌细胞间和肿瘤间质中有更多的CD8+以及辅助T细胞浸润。此外，dMMR与pMMR相比，突变累积，产生更多“新抗原（Neoantigen）”,更易被免疫系统识别，这也是获益的可能机制。

《2017 NCCN结直肠癌指南》推荐PD-1免疫治疗单抗pembrolizumab和nivolumab可用于dMMR/MSI-H结直肠癌晚期治疗。此外，5月23日，FDA批准Keytruda用于所有具有高度微卫星不稳定性（MSI-H）或者错配修复缺陷（dMMR）实体瘤患者的治疗。这是首次不分肿瘤类型，仅考虑肿瘤标志物治疗药物。从“同病异治”到“异病同治”，具有划时代的意义。

图5 PD-1/PD-L1与dMMR

肿瘤突变负荷（Tumor Mutation Burden,TMB），通常定义为每个癌症病人外显子测序每百万碱基（MB）的非同义突变数目。文献资料显示TMB可能成为肿瘤潜在的生物标记物。美国纪念斯隆-凯特琳癌症中心的Leonard B. Saltz等报告的一项研究对224例结直肠癌患者通过自定义杂交捕获进行二代测序，肿瘤突变负荷按照除拷贝数及结构重排的非同义突变数目计算，并同时进行免疫组化检测错修复基因表达水平。研究发现193例错配修复基因正常(pMMR)患者突变数＜20；突变数≥20的31例患者中，28例（90%）是错配修复基因缺陷(dMMR)。剩余的3例因为维护基因组稳定的基因PLOE发生P286R突变，伴有高负荷突变，导致3例pMMR突变数均＞150，这种情况也很容易被识别。

图6 结直肠癌中的肿瘤突变负荷情况

如图6所示，作者将突变负荷设定为≥20且＜150定义为dMMR,，则用基因二代测序预测MMR的状态的灵敏度和特异性都是1.0（95%CI，0.93~1.0）。该研究基于dMMR肿瘤中突变累积较多，将MMR状态与肿瘤负荷建立对应关系。提示TMB可作为结直肠癌MMR检测的标志物。

（一） 错修复蛋白（免疫组化法）

（二） 焦磷酸测序技术服务

焦磷酸测序以目标DNA的一条单链为模板，以测序引物作为引导链，通过四种酶的级联反应将核苷酸链的延伸过程转化成荧光信号。

1 MLH1 甲基化检测

MLH1 属于 MMR 家族的错配修复基因，是细菌错配修复基因 mutL 的同源物。该基因定位于 3p21，其基本功能是与其它的 MMR 蛋白相互作用形成一种多聚复合物，消除 DNA 复制过程中由于 DNA 聚合酶滑移而引起的碱基错配、插入以及缺失的形成。MHL1 基因启动子区的甲基化与多种肿瘤的发生发展密切相关。

在结直肠癌中，15%经MSI途径发生。其中约12%为散发性 MSI 结直肠癌，发生机制为MLH1 基因启动子发生甲基化使该基因沉默、发生微卫星不稳定性而致的 CRC。此外，由 MLH1、 PMS2、 MSH2、 MSH6 等 MMR 基因发生胚系突变所致Lynch 综合征，约占3%。如图7所示，lynch综合征与散发性MSI结直肠癌的鉴别筛查过程中,MLH1启动子甲基化检测在筛查中起重要作用。

图7：lynch综合征与散发性MSI结直肠癌的鉴别筛查过程

2 B-raf 基因突变检测

B-raf 是一种癌基因，它编码一种丝/苏氨酸特异性激酶，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK 通路重要的转导因子，参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡等。研究表明，在多种人类恶性肿瘤中，如恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的 B-raf 基因突变，约 66% 恶性黑色素瘤和15％的结肠癌中 B-raf 基因存在体细胞错义突变。大约 80-90% 的 B-raf 基因突变发生在 exon15的 1799 核苷酸上，T 突变为 A，导致其编码的谷氨酸由缬氨酸取代 (V600E)。目前认为，V600E 突变可模拟 T599 和 S602 两个位点的磷酸化过程，从而使 B-raf 蛋白异常激活。

在结直肠癌中，散发性的MSI结直肠癌约有63.5%存在B-raf V600E突变，但lynch综合征中基本无B-raf V600E突变。如图7所示，B-raf V600E突变可以用于lynch综合征与散发性MSI结直肠癌的鉴别诊断。

此外，2013 年 4 月出版的美国医学协会杂志（journal of american medical association，JAMA）报道了 BrafV600E 对甲状腺人乳头瘤（Papillary Thyroid Cancer, PTC）预后的影响。文章指出 BrafV600E 突变极大的影响了 PTC 病人的存活率等一系列预后指标。B-raf 突变状态与多种肿瘤的发生、发展及临床结局有关。随着 B-raf 突变研究的深入，可望为阐明肿瘤发生的分子机制，寻找新的治疗途径与靶点提供思路。

参考文献：

参考文献太多，此处不一一列举。